无机硒是什么(无机膳食补硒对生长中羔羊肌硒蛋白和脂质代谢基因作用)

农村养殖畜牧网养羊技术 2023-10-21 18:54:07 353

文 |入梦菲记

编辑 |入梦菲记

引言：

补充硒（Se）对反刍动物，特别是羔羊硒蛋白和脂质代谢基因表达模式的影响尚不完全清楚。研究的目的是评估补充硒对生长中的羔羊中选定硒蛋白和脂质代谢相关基因的信使RNA（mRNA）表达模式的影响。

本次研究表明，在羔羊中，与其他物种类似，几种硒蛋白的mRNA表达模式高度依赖于饮食中的Se水平，并且它们的表达受分层原理和组织特异性机制的支配，硒摄入量的变化导致与脂质代谢相关的不同水平的基因表达。

硒蛋白在动物中广泛运用

硒蛋白对其信使RNA（mRNA）水平的表达模式和影响因组织和物种而异。在脑、肝、脾、睾丸、甲状腺以及心脏和骨骼肌中观察到不同水平的表达。

发现硒蛋白（如GPXs）在肝脏、肾脏和肌肉中表达，而在各种组织中检测到SELW和SELN mRNA转录本，特别是在肌肉中更为丰富。

膳食硒缺乏和硒补充剂对硒蛋白基因表达的影响已在大鼠，小鼠，猪，牛和鸡中进行了研究、硒蛋白的合成受Se补充剂水平的影响，其mRNA表达以分层方式控制。

在哺乳动物中，GPX1、GPX3和SEPP1的mRNA水平随着硒缺乏而显著降低，而其他几种硒蛋白包括GPX4、SEPP1、TXNRD1和DIO1，后者在肝脏、肾脏、甲状腺和其他组织中的mRNA水平相对不变。

目前，在啮齿动物和猪以及人类中深入研究了响应硒营养变化的特定基因表达的调节，但没有对反刍动物，特别是羔羊的研究。

因此，我们本研究的目的是研究硒酸（0.5 mg Se / kg）形式的口服硒酸盐补充剂如何改变选定硒蛋白基因（GPX1，GPX2，GPX4，SEPP1，SEPM，SEPN1，SEPW1，SELO，SEP15，SEPHS2，TXNRD1和MSRB1）

动物与饮食

该实验是在波兰Jastrzębiec的IGAB PAS研究所农场饲养的48只单胎波兰美利奴公羊身上进行的。在8周时，所有羔羊断奶并随意饲喂基础日粮（BD）2周以调整其硒状态。

适应期后，将动物单独转移到稻草床围栏并分为两组，随意喂食基础饮食（BD）且不补充Se的羔羊，以及II-补充（S）-随意喂食BD的羔羊，每盎司补充0.5mg Se / kg作为硒酸钠（Na2筝尾4） 8 周。

BD由燕麦（40%），黑小麦（29%），豆粕（19.5%），菜籽油饼（10%），石灰石（1%）和NaCl（0.5%）组成。BD中天然硒的浓度为0.1毫克/千克干物质（DM）。

此外，在补充期间，为确保瘤胃功能正常（0.1毫克Se/kg DM），每天提供约0.09公斤草甸干草/羔羊。每天记录BD的个体摄入量。

在补充硒开始时记录单个羔羊的体重，然后每周记录一次。为了制备血浆样品，在实验开始和结束时从个体羔羊身上收集血液。

等离子体硒浓度通过电感耦合等离子体原子发射光谱（ICP-AES）（Optima 5300 DV，Perkin Elmer）测定。在18周时，宰杀羔羊并收集肝脏和背长（LD）样本。立即用液氮冷冻组织样品并储存在-80°C。

RNA分离和cDNA合成

根据制造商的说明，使用高纯RNA组织试剂盒从肝脏和背长肌样品中分离总RNA。在ND-1000 NanoDrop分光光度计上对分离的RNA进行了定性和定量评估。

仅使用RNA超过100 ng且吸光度比A260/280和A260/230约为2.0的样品进行进一步分析，为了确认RNA质量，使用生物分析仪进行了快速电泳分析。

RNA用转录第一链cDNA合成试剂盒逆转录成cDNA，在1μM寡核苷酸（dT）存在下，将0.65μgRNA在10°C下变性50分钟。

逆转录混合物（总体积20μl）含有13μlRNA，4μl逆转录酶缓冲液，2μl10mM dNTP，0.5μl保护性RNase抑制剂（40U / μl）和0.5μl逆转录酶（20U / μl），将混合物在50°C下孵育60分钟，然后在85°C下孵育5分钟，最后在-20°C下储存。

底漆设计

基因表达引物采用Primer3Plus设计，符合GenBank Ovis aries序列和符合外显子-外显子边界的扩增子序列，测定了17个基因的相对mRNA丰度。

与脂质代谢相关的三个基因（脂蛋白脂肪酶，LPL;肝X受体α，LXRα;过氧化物酶体增殖物激活受体α，PPARα）和三个参与胆固醇代谢的基因（对氧磷酶1，PON1;载脂蛋白E，APOE;24-脱氢胆固醇还原酶，DHCR24）。

实时荧光定量 PCR 检测

使用光循环仪96系统在总反应体积为96μl的10孔光学反应板中进行qPCR。反应混合物由1μl每个引物组成。5 μl SYBR 绿色预混液（瑞士罗氏诊断）、2 μl PCR 级水和 50 ng cDNA。

扩增程序包括：在10°C下初始变性95分钟，变性40个循环（10秒，95°C），退火（9秒，59-61°C）和伸长（20秒，72°C）。靶基因和参考基因的qPCR扩增一式三份进行。

包括含有模板RNA和所有PCR试剂（但不包括逆转录酶）的阴性对照，以确定DNA污染的RNA纯度。使用两个参考基因对qPCR数据进行标准化：β-肌动蛋白（ACTB）和甘油醛3-磷酸脱氢酶基因（GAPDH）。使用Δ循环阈值（ΔCt）方法。

其中，ΔCt值是靶基因和参照基因（Δ克拉 = 克拉目标–CT参考).对于每个靶基因，计算标准化的相对表达（2−ΔΔCt，是ΔΔ克拉 =ΔCt 样品–ΔCt 控制）。

假设靶基因的表达量为1，假设其Ct为27（硒蛋白），30（脂质代谢基因），参考基因GAPDH / ACTB为22，其ΔCt用作对照。每个样品的PCR反应一式三份进行。

血浆中的生长性能和硒浓度

羔羊补充期开始和补充后平均体重分别为14.2 ± 0.3和31.2 ± 0.5 kg，C组和S组羔羊比较差异无统计学意义（P > 0.05）。

每只羔羊平均日采食量分别为0.97±0.2千克BD和0.085千克草甸干草，C组和S组羔羊相似，在研究期间没有观察到消费差异（P > 0.05）。

C组每只羔羊的平均每日硒摄入量为0.15毫克硒/千克，S组为0.65毫克硒/千克。实验前C组血浆硒浓度分别为1.11±0.09μmol/l和S组1.12±0.11μmol/l。

在实验结束时，S组（0.05±1.47μmol/l）与C组（0.19±1.19μmol/l）（P <0.15）的羔羊的最终血浆硒浓度明显增加（P < 0.05）。

硒蛋白mRNA的丰度

为了研究硒状态差异对抗氧化硒蛋白mRNA表达的影响，我们确定了GPX1，GPX2，GPX4，SEPP1，SEPM，SEPN1，SEPW1，SELO，SEP15，SEPHS2，TXNRD1和MSRB1的肝脏和肌肉表达模式。

我们的结果表明，这些基因的表达以三种模式响应膳食硒浓度。在第一项研究中，补充硒导致肝脏中（P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001）GPX1， SEPW1，SEP15和TXNRD1 mRNA水平增加和S组LD肌肉中的GPX1，SEPP1，SEPN1，SEPW1，SEP15和MSRB1（0.65mg Se / kg）与C（0.15毫克硒/千克）羔羊组相比。