文|浮生

编辑|浮生

前言

猪圆环病毒属圆环病毒科、圆环病毒属，基因组为环状单股负链DNA，大小约为1.7kb，病毒粒子呈二十面体对称，直径约17~20nm之间，无囊膜。

PCV于1974年在德国首次被发现，随后确定猪圆环病毒2型(porcinecircovirustype2，PCV2)具有致病性，目前已发现PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d和PCV2e共5种基因型。

根据病毒粒子的形态特征和结构特征分析发现PCV2基因组有11个开放阅读框（openreadingframe，ORF），ORF1、ORF2、ORF3、ORF4、ORF7和ORF8具有一定的同源性，ORF1、ORF5、ORF7和ORF10在正链上，其他的ORF均处于负链上。

PCV2主要通过水平、垂直传播的途径感染猪群。水平传播主要通过接触PCV2患病猪的排泄物，垂直传播主要通过胎盘屏障进行感染，一般哺乳期的仔猪不易感染，主要感染保育阶段的仔猪，对养猪业危害较大。

材料与方法

病料组织于2021年6月在黑龙江省某猪场采集的疑似PCV感染仔猪的组织病料，包括心、肝、脾、肺、肾、淋巴结和小肠组织。

临床症状表现为采食量减退，被毛粗乱竖起，生长缓慢，呼吸困难，腹泻并最终死亡。

pMD19-Tsimple购自宝生物工程(大连)有限公司，病毒DNA纯化试剂盒、DL2000DNAMarker、Trans2KDNAMarker和2×EasyTaqPCRSuperMix均购自北京全式金生物技术有限公司。

DMEM高糖培养基、青链霉素和胎牛血清（FBS）均购自Gibco公司。总RNA极速提取试剂盒购自上海飞捷生物技术有限公司。

引用文献中检测病料所用的PCV3、PPV、CSFV、PRV、PRRSV与PEDV特异性引物，参考SDWF1805株的基因序列设计并合成PCV2的鉴定引物及分段测序引物。

将病料进行研磨处理后，分别按照北京全式金生物病毒DNA/RNA纯化试剂盒说明书提取病毒DNA及RNA。

利用PCV2与PCV3的Cap基因引物、PRV的gB基因引物和PPV的VP1基因引物分别进行PCR扩增，用东北农业大学预防兽医学实验室保存的检测引物对CSFV、PRRSV、PEDV与TGEV的特异性目的基因进行PCR扩增。

PCR扩增体系（总体积为25μL）：2×EasyTaq-SuperMix12.5μL，上下游引物各1μL，DNA模板1μL，ddH2O9.5μL。

PCR扩增程序：95℃预变性5min，35个循环（95℃20s，57℃30s，72℃1min），72℃延伸10min。

提取PCV2阳性组织DNA，对其进行PCR扩增，扩增产物进行测序，测序正确后使用Oligo6软件针对其全基因序列设计2对测序引物PCV2JF1/R1（引物起止位置116bp~1161bp）、PCV2JF2/R2（引物起止位置863bp~193bp），对PCV2全基因序列分段扩增，PCR扩增片段送吉林省库美生物有限公司测序后拼接为全基因序列。

将鉴定为阳性且测序正确的病毒液无菌接种至PK-15细胞，细胞长至70%~90%时弃掉旧培养液，PBS缓冲液清洗2次，弃净；加入300mmol/LD-氨基葡萄糖于37℃、5%CO2培养箱作用30min；

PBS缓冲液清洗2次，弃净；加入含有2%血清的DMEM继续培养48h。收集病毒液反复冻融3次，分装冻存于-80℃备用。提取病毒DNA进行鉴定，并在PK-15细胞连续传代培养。

将病毒液同步接种于PK15细胞中，混合均匀后铺于96孔板，每孔100μL，置于37℃培养箱培养48h。

取长至80%的细胞培养物，PBS轻柔冲洗细胞3次，加入100μL固定液，室温作用30min；弃液，PBS清洗细胞3次，每次5min；加入200μL穿孔素（2%Triton100）室温穿孔10min；PBS清洗细胞3次，拍干。

加入封闭液200μL，室温作用30min；PBS清洗后拍干，每孔加入1∶20稀释的藻红蛋白标记的PCV2单克隆抗体（4D2）200μL，放置37℃孵育1h，避光回收抗体于-40℃保存；避光条件下PBS清洗后使用DAPI对细胞核进行染色，并使用PBS清洗后于显微镜下观察荧光情况。

取400mL反复冻融2次的细胞病毒液，4℃12000r/min离心30min；取上清，4℃30000×g离心3h，弃去上清液，使用2mLSTE缓冲液悬起沉淀。加入终浓度为1%的猪阳性血清，4℃过夜；4℃12000r/min离心30min，500μL灭菌水重悬沉淀。磷钨酸负染色2min，电镜下观察病毒粒子的形态特征。

利用DNAMan软件对分段扩增的序列比对分析后拼接其全基因组序列。将PCV2LJ1606株全基因组序列以及ORF2基因与Genbank中已发表的21株PCV2代表毒株，利用Megalign软件进行比对，分析核苷酸同源性和各基因突变情况。

利用RDP4（recombinationdetectionprogram4）软件中7种重组检测算法和Simplot软件对分离株的全基因组进行重组分析；利用Mega7.0软件对分离株的基因组进行系统发育分析。

结果分析

提取病料的DNA或RNA，使用特异性引物对其进行PCR扩增。结果显示，成功扩增出约702bp的特异性片段，与预期一致，且未扩增其他病毒的特异性目的基因，说明该病料中仅含有PCV2。

对PCV2全基因组进行PCR扩增，结果显示，在约1767bp出现目的片段，与预期一致。

将处理后的P4代病毒液接种于PK-15细胞，与藻红蛋白标记的PCV2Cap蛋白单克隆抗体结合，免疫荧光鉴定显示，感染了P4代病毒的PK-15细胞会产生橙红色特异性荧光，而对照组细胞未见特异性荧光，表明分离的PCV2在PK-15细胞中获得有效增殖。

将收集的病毒液经超速离心和磷钨酸负染色处理，免疫电镜下观察病毒粒子的形态特征。结果显示，病毒颗粒呈球形、无囊膜，直径约17～20nm，符合圆环病毒的特征。表明成功分离该株PCV2，将其命名为LJ0616株PCV2。

利用DNAStar软件对GenBank中选取的24株PCV代表毒株的全基因组核苷酸序列进行同源性比对分析。

LJ0616株与其他21株PCV2代表毒株的全基因组核苷酸序列同源性为55.2%~99.8%，与PCV1全基因组核苷酸序列同源性为46.7%，与PCV3和PCV4全基因组核苷酸序列同源性仅为14.2%和23.5%。

LJ0616株与2018年中国山东发布的SDWF18095毒株、2017年中国甘肃发布的FJ1303毒株以及2018年巴西发布的GS1403毒株的核苷酸序列同源性高达到99.8%，与2008年丹麦发布的DK1980PMWSfree毒株的核苷酸序列同源性最低为55.2%。

进一步将LJ0616株ORF2的核苷酸序列与其他代表毒株的核苷酸序列同源性进行比对分析，同源性为96.7%~100%，与ML-7和HB1302毒株ORF2序列同源性高达到100%。

对24株PCV全基因组序列构建系统发育树，LJ0616株PCV2与PCV1、PCV3和PCV4形成4大分支，遗传关系较远。

结果表明LJ0616株属于PCV2血清型。进一步构建ORF2基因的系统发育树，结果如图7所示，LJ0616株PCV2与中国甘肃毒株FJ1303的亲缘关系最近，因此LJ0616株PCV2属于2d亚型。

根据分子流行病学调查分析，PCV2的感染率呈逐年上升趋势，并且PCV2能造成免疫抑制，引起继发性免疫缺陷，给养猪业造成巨大的经济损失，因此对于该病毒致病机制的研究以及病毒与宿主之间的相互作用是目前的研究重点。

PCV2除了是断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的病原，同样能够引发猪皮炎肾病综合征（PDNS）、母猪繁殖障碍、猪呼吸道疾病（PRDC）和仔猪震颤（CT）等，因此采集到病料可能含有除PCV2以外的病毒。

本研究使用PCV3、PRRSV、CSFV、TGEV、PPV、PEDV与PRV的鉴定引物对PCV2阳性病料进行检测，结果显示未扩增到上述病毒的目的基因。

虽然PCV2能够在PK15细胞上增殖，但是PCV2不会产生细胞病变，随着PCV2的连续传代，病毒滴度会逐渐降低，对其检测和繁殖较为复杂，因此需要进一步探究增强病毒复制的条件和方法。

经过实验证明，D-氨基葡萄糖作用于接种PCV2的PK-15细胞能够加速病毒进入细胞核，增强病毒的增殖，使病毒滴度得到提升。

本研究将阳性病料研磨，以1∶10的比例将病毒液与细胞悬液混合，同步接种于PK-15细胞，使用300mmol/LD-氨基葡萄糖作用接种病毒的细胞，作用后使用PBS缓冲液对细胞进行清洗，防止D-氨基葡萄糖对细胞产生较大的损伤，继续培养24h后收取病毒。

接种病毒的细胞反复冻融2次，分装病毒液于-80℃保存，取部分病毒样品进行PCR检测。经PCR对病毒液进行初步检测后，使用免疫荧光检测P4代病毒在细胞中的增殖能力，结果显示LJ0616株PCV2在PK-15细胞中获得有效增殖。由于PCV2基因亚型不断增多，因此了解本地区PCV2病原流行情况对疫苗的研发至关重要。

最初在我国流行的基因型为PCV2a和PCV2b，二者的核苷酸同源性为90%。张智明等对2012~2014年PCV2阳性毒株进行分析，发现11株分离病毒中6株为PCV2b基因型，3株为PCV2a基因型，2株为PCV2d基因型。

陈指龙等通过荧光定量PCR检测到PCV2，对其遗传进化进行分析发现该毒株为2d亚型，且PCV2d型毒株之间的差异主要位于B细胞表位区，根据我国流行的优势毒株流行情况分析发现，PCV2d基因型逐渐替代PCV2b基因型。

结语

本研究利用PCR方法对LJ0616株PCV2的全基因组序列进行分段扩增及测序，拼接其全长序列为1767bp。

对PCV2核苷酸序列分析，LJ0616株PCV2与其他PCV2代表毒株的核苷酸序列同源性为55.2%~99.8%，在重组分析过程中，并未发现本研究分离毒株LJ0616株PCV2的全基因组序列存在重组情况。

综上所述，本研究中分离获得1株PCV2d亚型流行毒株，为PCV2的生物学特性与致病机制研究奠定了基础，对PCV2分子流行病学提供了数据参考。

参考文献

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